荧光显微镜标本制作要求及制作方法

荧光显微镜标本制作要求

(一)载玻片

载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。

(二)盖玻片

盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质(如氟化镁)的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光女可激发标本。

(三)标本

组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。

(四)封裱剂

封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。

(五)镜油

一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。

三、使用荧光显微镜的注意事项

(1)严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。

(2)应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5～15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。

(3)防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。

(4)检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3～5min后，荧光也明显减弱；所以，最多不得超过2～3h。

(5)荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节　省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。

(6)标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。

(7)荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“一”—无或可见微弱荧光。“+”—仅能见明确可见的荧光。“++”—可见有明亮的荧光。“+++”—可见耀眼的荧光。

四、荧光图像的记录方法

荧光显微镜所看到的荧光图像，一是具有形态学特征，二是具有荧光的颜色和亮度，在判断结果时，必须将二者结合起来综合判断。结果记录根据主观指标，即凭工作者目力观察。作为一般定性观察，基本上可靠的。随着技术科学的发展，在不同程度上采用客观指标记录判断结果，如用细胞分光光度计，图像分析仪等仪器。但这些仪器记录的结果，也必须结合主观的判断。

荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要，由于荧光很易褪色减弱，要即时摄影记录结果。方法与普通显微摄影技术基本相同。只是需要采用高速感光胶片如ASA200以上或24。以上。因紫外光对荧光猝灭作用大，如FITC的标记物，在紫外光下照射30s，荧光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能将荧光图像拍摄下来。一般研究型荧光显微镜都有半自动或全自动显微摄影系统装置。

标本的制作方法

样品须经过石蜡包埋切片，然后用铁矾苏木精染色，普通光镜观察效果还可以.

作荧光观察需用荧光染料DAPI染色，

石蜡切片的过程：

1. 取材: 刀片要求锋利而薄,组织厚度约2—3mm, 大小1.5×1.5×0.2～0.3cm为宜. 取材时间越快越好.

2. 固定: 组织取下后应立即放入10%福尔马林(相当于4%甲醛)固定.

注意: (1). 固定液量应为组织块体积的40倍.

(2) 固定时间固定时间与使用的固定液种类和组织块大小, 温度等有关. 一般为3—24h.

(3)固定温度大多可在室温固定, 在低温(4℃)时间应延长.

(4)固定容器应大些.

3. 漂洗: 流水冲洗2—10h.

4. 脱水: 从低浓度酒精到高浓度酒精.

70%(数分钟)→80%(60-120’)→90%(60-120’)→95%(60-120’)→95%(60-120’)→100%(60-120’)→100%(60-120’).

5. 透明: 组织块脱水后必须经过一种既能与酒精混合又能溶解石蜡的溶剂, 而使石蜡进入组织块. 常用二甲苯, 一般浸泡30m即可.

6. 浸蜡: 组织经透明后在熔化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡. 一般需经2—3次浸渍才能完成, 总时间为3—4h. 用于浸蜡的石蜡熔点为52—56℃.

7. 包埋: 先将熔化的石蜡倒入包埋框再用加热的镊子将组织块放入. 包埋面必须平整. 包埋后石蜡稍凝后可移入冷水或冰箱中加速凝固.

8. 切片: 修块→切片→展片→捞片→烤片.

也可作冰冻切片.

荧光染料的配制：

储藏液：1mg/ml dapi(DMSO、去离子水、pbs都可以溶解)

工作液：通常1μg/ml

染色时须避光，10min左右

用pbs冲去多余染液即可观察。