超高分辨率荧光显微镜的应用前景

1、 光学显微镜的出现及其影响自荷兰博物学家、显微镜创制者Antonie van Leeuwenhoek(1632-1723)在17世纪第一次将光线通过透镜聚焦制成光学显微镜并用它观察微生物(microorganisms or animalcule)以来，显微镜就一直是生物学家从事研究工作、探寻生命奥秘必不可少的利器。正是因为有了Leeuwenhoek的这项伟大发明及其后继者对显微镜技术的不断改进和发展，人们才能够对细胞内部错综复杂的亚细胞器等结构的形态有了初步的了解。

此后，研究人员对显微镜技术的追求从未停歇过，他们总是希望能得到分辨率更高的显微镜，从而更好地观察细胞内 部更细微的结构。最近，《自然-方法》(Nature Methods)杂志上报道的超高分辨率成像技术(super-resolution imaging, SR imaging)终于使得人们可以在单分子水平上进行观察研究。

2 、SR技术的发展过程

在达到今天SR技术水平的过程中，承载了许许多多研究人员辛勤劳动的汗水，也面临着诸多亟待解决的难题。

在以上这些光学SR成像技术中有两种技术——受激发射减损显微镜(stimulated emission depletion microscopy, STED)和饱和结构光学显微镜(saturated structured illumination microscopy，SSIM)最受关注。

最近，基于探针SR成像技术的光敏定位显微镜(PALM)和随机光学重建显微镜(STORM)，以及借助荧光基团随机激活特性的荧光光敏定位显微镜(FPALM)都已经取得了成功。

通过基于探针的SR成像技术，可以获得多张原始图像。在每一张原始图像中，细胞内只有一部分被荧光标记的分子能发出荧光，即这些荧光分子都处于不断激活和灭活的交替状态，每一次都只有部分分子能被观察并成像。而且由于每次发出荧光的分子都分散得较为稀疏，因此相互之间不会受到影响，也就避免了因相邻分子发出荧光而无法分辨的问题。最后将这些原始图片叠加、重合在一起就得到了最终的高分辨率图像。这样，就能使得那些以前由于荧光点太密以至于无法成像的结构的分辨率达到纳米级水平，而且成像的分子密度也相当高，可以达到105个分子/μm2。

这种分辨率对于生物学家来说，意味着现在可以在分子水平上观察细胞内的结构及其动态过程了。

虽然显微镜技术已经发展到了如此高度，但它仍然只是生物学家研究中使用的一种工具。因此还需要将显微镜获得的图像与其它的试验结果互相参照，才能获得准确的结果。人们需要认清SR显微镜的优势与劣势，为操作以及判断SR图像制定出标准化的操作规范，只有这样才能最大限度地发挥SR显微镜的作用。

现在，由于人们对细胞内各组份的组织结构以及它们的动态变化过程都只有一个概念上的认识，因此，借助显微镜从纳米水平上对这些结构及过程进行真实的观察能让人们发现许多以往所不了解的东西。例如，以前人们通过电镜发现细胞骨架是由大量丝状网格样组织构成时，就有人对此现象持怀疑态度。那些认为细胞骨架是一种用来稀释细胞内生化物质浓汤这样一种结构的细胞生物学家把这种观测结果称作僵化的人为试验结果。

除非最新的SR显微镜图像或者其它的试验结果都能证明细胞骨架是由大量的丝状网格样组织构成的，否则还会有人持上述的怀疑观点。不过已经有其它的生化试验结果证实了早期的电镜观察结果是正确的。当然新兴的SR技术也需要其它传统的生化试验结果予以佐证才有价值，同时还需要电镜的辅助。因为电镜能提供纳米级的观察结果，这对于佐证具有同样分辨率的SR显微镜观测结果来说是最有价值的。

今后，大家在逐步了解、接受和广泛使用SR显微镜的同时，需要注意将会出现的各种问题，以下的表格列出了部分与SR显微镜使用相关的缺点及其目前的解决方法。

最近几年，就如何处理图像已经有了非常严格的操作规范。不过迄今为止，对于怎么处理SR图像还没有一个标准的操作规范。尤其需要指出的是，PALM和STORM数据在某些重要因素上，graph方面的共性要多于image方面。在一张SR图像上，分子的不确定性和密度都能用颜色表示出来，这种图像把细胞内该分子有可能出现的任何地点都标示出来了。而且只有被标记的分子按照一定的标准(发出的光子数)判断它的确是一个单分子并且定位准确之后才显示出来。必须对获得的图像进行这样的标准化处理之后才能分析结果。同样，对于试验数据也需要如此进行标准化处理。要提高分辨率不仅需要分子定位、分布得比较好，还需要分子数目够多，以致能达到尼奎斯特判断法(Nyquist criterion)的要求，即分子间的平均距离要小于显微镜分辨率的一半。虽然上述问题都不会影响SR显微镜的应用，但由于存在这些问题，所以我们应该时刻提醒自己，一定要仔细判读、分析SR显微镜的图像结果，只有这样才能得到有价值的生物学结论。

3、 SR荧光显微镜在生物学研究中的应用

到目前为止，人们还很难得知，SR荧光显微镜会对生物学界的哪一个领域带来重大变革，但已经有几个领域出现了明显的改变。这些研究领域是动态及静态的细胞组织结构研究领域、非均质分子组织研究领域、蛋白动态组装研究领域等。这几个领域都有一个共同的特点，那就是它们研究的重点都是分子间如何相互作用、组装形成复合物。因此，能在纳米水平观察这些分子对它们来说具有重大的意义。

1、通过观察蛋白质之间的组合关系来了解它们的作用，并能为后续的细胞功能试验打下基础

结构生物学研究在这方面已经取得了很大的进展，目前已经发现了4-8纳米大小的分子间相互作用组装成细胞微管、肌丝、中间丝这些超过10微米大小聚合物的机制。不过对于核孔复合体、中心体、着丝点、中间体、粘着斑这些由许多不同蛋白经过复杂的三维组装方式组合起来的复合体，还需要更好的办法来进行研究。目标就是要达到分子水平的分辨率，这样就可以观察大复合体形成过程中的单个分子，也就能对这些分子的化学计量学有所了解了。要得到更多的生物学信息就需要SR显微镜这样的三维成像技术，例如可以使用活体细胞SR成像捕捉细胞骨架的动态重构过程等等。

2、 SR成像有助于人们更好地了解分子间的差异

细胞膜蛋白组织方式的经典模型已经从随机分布的液态镶嵌模型转变成了脂筏模型、穴样内陷模型或特殊蛋白模型。这种差异与细胞不同功能相关，例如在高尔基体、cargo蛋白和高尔基体酶蛋白之间必须发生相互作用，但最终它们会按照各自的功能分开，发挥各自的作用。有很多试验手段，例如免疫电镜技术、荧光共振能量转移技术(FRET)等都已经被用来研究这种膜不均一性问题了。多色PALM技术(Multicolor PALM)为人们提供了一种新的手段用来观察膜蛋白集合、组织的过程，并且还能定量分析不同蛋白间的空间距离关系。因为有了PALM提供的单分子信息，人们就可以清楚地了解蛋白分子间的空间关系，甚至有可能计算出相隔某一距离的分子之间发生相互作用的可能性。这种方法除了用于研究膜蛋白之外，还能用于许多非随机分布的生物系统研究，例如研究微管上的马达蛋白。

3、 SR成像技术还能用于在单分子水平研究蛋白动态组装过程

细胞对外界刺激信号的反应起始于胞膜，在胞膜上受体蛋白之间发生动态的集合，用来调节细胞的反应活性。像HIV这种有被膜病毒也是在细胞膜上完成病毒颗粒组装过程的病毒，也是利用了细胞的物质转运机制。尽管现在蛋白组装的物理模型还远远没有完成，但研究人员知道膜蛋白的动态组装过程是不均一的，所以通常使用荧光试验手段很难获得分子水平上的信息。同样，单分子测量技术(Single molecule measurements)也存在着类似的局限，因为单分子测量技术只能观察细胞内的几个分子，所以缺乏整体的信息。因此由于缺乏空间分辨率，很难动态地研究蛋白质组装过程。SR荧光成像技术与活细胞成像技术和单分子示踪技术(sptPALM)结合就能解决这一问题。我们可以借助分子密度准确地看出PALM图像中的蛋白质簇，蛋白质簇动态的统计数据和形态学数据能帮助我们了解蛋白质动态组装的机制。

上面只是选了生物学研究中的3个方面来说明SR技术的用途，但这已经很好的展示了我们是如何从Leeuwenhoek最初对于生命组成的假设一步一步走到了今天，使用SR显微镜来证实构成生命体的最基本材料——分子的组合过程。STED和PALM的商业化产品已经上市了，这标志着SR显微镜的时代来临了。我们相信SR显微镜在充满创造力的生物学家们手中，一定会充分发挥它的作用，帮助我们发现更多生命的奥秘。

三 可诱导多潜能干细胞技术新进展

近几年，将体细胞重编程为多潜能干细胞的技术已经有了很大的改进和提高。可以预见，将来这些技术还会得到进一步的发展。现在，关于这方面的生物学研究不断涌现。

早在一年前，人们就将可诱导多潜能干细胞(induced pluri-potent (iPS) stem cells)技术作为一个值得关注的研究领域进行了相关报道。但直到最近，该技术(在体细胞中表达几种转录因子即可将体细胞重编程为iPS细胞)才能成功应用于人体体细胞。

该技术体系的用途之广泛是显而易见的。例如，可以用于研究人体早期发育过程、构建疾病模型或应用于临床治疗等等。然而该技术还是存在几个亟待解决的问题。

值得高兴的是，目前已经有多个实验室在iPS技术的以下几个方面取得了进展。有的实验室能对更多种类的体细胞进行重编程;有的实验室能使用小分子而非转录因子成功重编程体细胞;还有的实验室操作过程中使用的转录因子比以往少几种，但重编程效率却较之以往提高了100倍。现在，筛选哪些转录因子或小分子物质，对于重编程来说是必须的研究，而且还在进行之中。

最近有报道称，在小鼠体细胞内瞬时表达重编程因子也能成功获得iPS细胞。这就避免了使用病毒载体转染细胞表达转录因子这种传统方法可能造成的病毒整合入细胞基因组等问题的发生。

除了继续追求技术上的进步之外，科学家还将从基因表达、表观遗传学、细胞分化等各个方面深入研究iPS细胞本身的生物学问题，这些方面都将影响到iPS细胞将来的应用，并且我们坚信这将是未来iPS细胞研究领域发展的新方向。

四 人造生命

在人们成功合成人造基因组之后，下一步就该是发挥这些基因的功能了。

合成生物学(见文后小词典)最主要的长期目标之一就是使用最小的、非冗余的基因组构建一个具有某种功能的活体生命。而短期内亟待解决的问题则是，如何使用未经加工的化学原料组装一个完整的基因组以及非必需基因(nonessential genes)等。

2008年，研究人员终于在基因组组装问题上取得了突破性进展。J. Craig Venter等人使用体外重组技术(in vitrorecombination strategy)将一段长约24Kb的寡聚核苷酸链和另一段更长的核苷酸链重组，然后将该重组体转入酵母细胞中，最终获得了长达582.9Kb的生殖支原体(Mycoplasma genitalium)基因组。Mitsuhiro Itaya等人则使用体内重组技术(in vivo recombination strategy)在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)内将一系列长约4~6Kb的多米诺骨牌样克隆(domino clones)组装在一起，获得了长约134.5Kb的水稻线粒体(rice chloroplasts)基因组。

接下来的工作就是检验这些人造基因组是否具有相应功能了。Venter等人已经成功将丝状支原体(M. mycoides)的基因组植入了山羊支原体(M. capricolum)细胞中，现在，他们准备将人工合成的生殖支原体基因组移植入山羊支原体细胞中，不过这一试验在技术上还是存在一定的难度，因为它并不能像将丝状支原体的基因组植入山羊支原体细胞中那么容易。而且人造基因组是否能在酵母细胞中正确组装，而不被胞内限制性核酸酶消化，并复制、编码形成一个活的细菌(支原体)还需要试验来进一步验证。另一个需要解决的问题就是如何优化密码子。人造基因组对于其宿主细胞来说是不能有毒性的。然而，一个完整的基因组必须被植入受体细胞中并且要能够表达出它自己编码的功能蛋白。

毫无疑问，这种人造生命技术与其它的新技术一样，肯定会引起众多的争议，甚至恐慌，但它对于了解生命，对于生命科学和医学的进步来说也的确会起到不可估量的作用。

五 图像自动识别系统

借助图像自动识别系统(Automated imaging)，人们能对显微镜下的图像进行定量分析，并拓展显微镜的用途。

自从显微镜诞生以来，它就一直是科学家进行科学研究的得力助手。不过，显微镜图像一直只能算是一个描述性的结果，不能进行定量分析，而且进行显微镜观察是一项非常费时、费力的工作，这些缺陷一直阻碍着显微镜的广泛应用。

当Antonie van Leeuwenhoek在15世纪60年代第一次使用他自制的显微镜观察到微生物的时候，当Santiago Ramón y Cajal在200多年前第一次观察到神经系统结构的时候，他们都已经花费了很长的时间来进行观察工作，同时还需要花费很长时间将镜下的一切描绘到纸上。今天，科学家使用比当年先进得多的显微镜以及电荷耦合照相机(CCD camera)就能马上获得比当年清晰得多的图像，但是对于大多数的生物学家来说，他们使用显微镜还是只能通过大量的镜下观察来得到一个描述性的图像结果而已。

不过现在，借助计算机技术以及各种复杂的算法，显微镜可以有更多、更大的作为了。如今，已经发展到使用计算机来控制显微镜进行大部分的图像采集工作，显微镜下的图像结果不仅仅是描述性的，还可以通过计算机的运算对图像结果进行定量分析。这一切进步都是以往单单使用肉眼进行观察所无法比拟的。

即使对于那些目前还不能进行自动化分析的项目，例如在体内或体外试验中分析大量细胞中的基因表达水平，如果能够进行自动化分析，也将大大提高检测的效率和定量分析的准确度。

自动图像采集技术需要一系列相关技术协同作用才能成功。例如，需要使用合适的算法、需要选择合适的结果分析方式等等。虽然这些技术正在逐渐被大家所了解和使用，但目前还只是刚刚开始，还不成熟，还需要进一步的改进，才能满足更多科研人员的实际需要。对于自动图像采集技术的新老用户来说，在使用的时候都要小心仔细地进行操作和分析，不过相比该技术所可能带来的令人激动的成果而言，这样的谨慎还是相当值得的。

六 定量质谱检测技术

现在，大量使用基于定量质谱检测技术的蛋白质组学研究方法来研究生物问题正变得越来越常见了。

使用质谱技术来检测蛋白质已经成为了一种常规方法，并且正越来越多地应用于蛋白质组学研究当中。但是要真正了解复杂生物体的生物学情况，还需要有关蛋白质表达水平方面的资料。不幸的是，传统的质谱检测技术还不具备定量的能力。

因此，在过去的10年间，从事蛋白质组学研究的科研工作者发明了一系列的稳定同位素标记策略(stable-isotope labeling strategy)，希望藉此获取定量信息。

同时，检测设备和生物信息学方面最近取得的进展也使得定量质谱检测技术成为了可能。仅就去年一年，就有好几项值得人们注意的蛋白质组学研究成果发表，尤其值得关注的是使用由Matthias Mann小组在2002年发明的细胞培养稳定同位素氨基酸标记技术(stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC)这类代谢标记技术(metabolic labeling techniques)获得的研究成果。2008年，Mann小组和其他科研人员发现，只需使用少量标记物，就可以对整只小鼠进行同位素标记，对细胞周期内的磷酸化动力学情况进行研究，了解miRNA对蛋白质组的影响效果，以及比较单倍体酵母和双倍体酵母的蛋白质组学情况等等。

不过，要对蛋白质水平进行绝对的定量，只能通过往已消化的蛋白质组样品中掺入已知数量的人工合成同位素标记肽段才能获得，这一方法是由Steven Gygi小组在2003年首先提出的。不过，在得到能代表所有蛋白质的同位素标记的水解肽段(isotope-labeled proteotypic peptides，这些肽段最有可能被质谱仪连续捕捉到)以前，要想得到蛋白质组的整体绝对定量数据是根本不可能的。

研究人员希望，在不久的将来能更好地运用同位素代谢标记的方法来进行研究，帮助人们使用质谱检测技术从蛋白质组学的层面。

七 膜蛋白结构解析技术新进展

蛋白表达、溶解和结晶这一系列技术瓶颈的突破，使得研究膜蛋白的原子结构成为可能。

细胞中有大约30%的蛋白质是膜蛋白，不过人们现在还不是很清楚这些膜蛋白的原子结构。到目前为止，在PDB(Protein Data Bank)的结构数据库中只有不到1%的资料是膜蛋白的结构数据。这不是说膜蛋白的结构不重要，相反，膜受体蛋白非常重要，它们是大部分药物的作用靶点。但由于一直缺乏很好的膜蛋白大量可溶性表达技术，因此也就得不到足够的蛋白结晶体用于结构分析。即使是结构基因组学(文后小词典)这项旨在分析每一个蛋白家族结构的学科，也因为存在技术难题而没有将研究重点放在膜蛋白上。

现在，经过传统结构生物学家和结构基因组学家的不懈努力，蛋白表达、溶解和结晶这一系列的技术瓶颈都得到了突破，并且已经出现了部分成果。

2007年和2008年，学术界接连发表了好几篇具有里程碑意义的文章，这几篇文章都是有关G蛋白偶联受体(G protein–coupled receptor, GPCR)结晶体结构这一传统结构学难题方面的论文。

诸如美国纽约膜蛋白结构协会(New York Consortium on Membrane Protein Structures, NYCOMPS)和膜蛋白结构中心(Center for Structures of Membrane Proteins, CSMP)这样的结构基因组学研究组织和其他的几家国际性研究组织正在携手共同努力制定一个高效的、规范化的技术流程来研究膜蛋白结构。到目前为止，已经得到了几个膜蛋白的结构资料。与此同时，不需要使用蛋白结晶体来研究结构的固态核磁共振(solid-state NMR)技术也得到了飞速发展，不过该技术在敏感度和分辨率方面还需要进行进一步的改进。

现在还不太可能得到一个“通用的、万能的”技术流程来分析所有的蛋白质结构，因此还需要开发出其它一些针对不同蛋白质结构分析的研究方法。我们相信，未来几年会出现更多的研究膜蛋白结构的方法，在PDB中也会找到更多膜蛋白结构数据。

八 光学显微镜观察较厚样品不再是难题

随着对较厚样品光学成像能力的增强，使用光学成像技术来观察活体内的生物过程正逐渐成为可能。

生物体都是三维结构的，即使活体状态下的细胞也很少会像它们在培养皿中那样呈现出单独的单层状态。不过，在进行活体研究时历来就存在技术困难，尤其是在活体成像技术方面更是没有什么突破。

生物组织大部分都是不透光的，而且对光的散射能力特别强，因此，观察较厚组织时很难获得质量较好的图像。例如，使用传统的共聚焦显微镜就无法观察厚度超过数百微米的样品，但果蝇幼虫(fruitfly larva)、哺乳动物的胚胎(mammalian embryo)或者组织切片等样品的厚度通常都要远远超过这个范围。另一方面，研究人员也希望能获得这些样品的整体图像，从而能对这些样品的组织结构和基因表达情况有个整体了解，不过这些要求对于传统的光学成像技术来说都难以达到。尽管现在有了核磁共振成像技术(magnetic resonance Imaging，MRI)，在观察的深度方面有了一定的提高，但图像的分辨率还远远达不到要求。

因此，在类似共聚焦显微镜(confocal microscopy)这类高分辨率的成像技术和能进行活体观察但分辨率较低的成像技术(如MRI)之间就出现了一道分水岭。不过，最近几年间出现的几种新的光学成像技术有望消除这道鸿沟。

单层光显微技术(light sheet microscopy)这项最近获得改进的传统技术能对厚达数毫米的样品进行观察，并能进行荧光成像。该技术已经成功用于观察细小生物体和胚胎组织。去年，有科研工作者使用改进的单层光显微技术观察斑马鱼胚胎在24小时内的发育状况，并获得了数千个细胞的整体图像。

相比之下,诸如光学投影层析成像技术(optical projection tomography，OPT)这类层析成象技术就需要先对样品进行多角度观察，然后再使用数字技术重建，才能获得三维图像。OPT可以对厚度达到10毫米的样品进行成像。去年，有人将OPT技术和体外器官培养技术结合起来，获得了发育中的小鼠肢芽(limb bud)组织迁移以及基因表达情况的图像。

虽然上述三维成像技术和其它的一些三维成像技术还没有被大众广泛接受，但人们相信，随着这些技术的不断改进，随着大家对这些技术的不断了解，它们很快就会得到广泛应用的。

九 试验验证miRNA靶基因

尽管现在人们可以越来越准确地预测microRNA的沉默效果，但还是需要高通量而且准确的直接验证技术来验证microRNA的沉默效果。

microRNA这个在生物科学史上具有重要意义的小分子，在2008年又一次成为了世人瞩目的焦点。microRNA通过与目标mRNA的3’UTR区域结合来阻止其翻译，具体作用机制可分为两种：一种是降解目标mRNA从而达到阻止其翻译的目的，另一种则是直接抑制mRNA的翻译过程。

为了了解细胞中基因的真正生物学意义，研究人员往往会使用很多microRNA分子来沉默细胞中大量的mRNA表达，有时候这些被沉默基因的数目甚至比所使用的microRNA数目还要多。而现在使用的计算机预测靶基因技术还不够成熟，非常容易出错。鉴于此，去年人们开始使用一种新型的大规模验证方法，即在硅片上进行microRNA靶基因验证的“湿试验(真正的试验而不是用计算机模拟的“干”试验)”。

由于采用了这种方法，研究人员在2008年取得了一系列的成果。Nikolaus Rajewsky小组和David Bartel小组都各自独立地将蛋白质组学与分子生物技术结合在一起，使用定量质谱检测技术检测了细胞里蛋白质组水平的蛋白表达变化情况，然后将这些蛋白表达的改变情况与特定microRNA分子的多少联系起来进行分析，以此来验证microRNA的靶基因沉默效果。因为microRNA作用的结果就是导致某些蛋白表达量的减少，因此在蛋白质组水平上进行定量的检测是应该可以检测到这些蛋白表达量下降的。因此，使用该技术从理论上说是能够准确判断microRNA分子是否能够有效沉默靶基因的。

另一种从整体水平上来检测microRNA靶基因沉默效果的办法就是降解组测序法(degradome sequencing)(降解组，见文后小词典)。Pamela Green小组和Michael Axtell小组曾经在植物研究中使用过这一种新方法。在研究microRNA靶基因沉默效果时科研人员对microRNA介导的mRNA降解产物进行了测序，然后再使用这些被测出的序列与microRNA数据库进行比对就能发现是哪些microRNA分子导致了这一种mRNA分子降解。这一技术在植物microRNA研究中应用得非常成功，能非常准确地预测出microRNA针对的靶基因。不过，在其它以前还未能很好进行预测的物种中，这种方法的准确率有多高还需要进一步的实验加以验证。

与此同时，生物信息学家还在不断丰富他们的数据库，希望用更多的数据加以比对，从而提高计算机预测的准确率。其中的一种比对方法就是mirWIP方法。该方法由Victor Ambros小组设计，他们使用的是已经经过免疫沉淀技术验证过的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)microRNA数据库及其相应靶mRNA数据库，希望这样能够提高计算机预测的准确率。

上述整体水平检测方法都极大提高了人们预测microRNA靶基因的准确率，也为人们进行下一步的试验验证工作提供了更准确的候选microRNA分子，不过最终还是需要高通量的“湿试验”来进行验证确认。

十 光调控细胞功能——新的研究方向

现在，人们不仅可以用光来观察细胞活动，还可以用光来控制细胞活动，这方面的研究正在兴起之中。

2005年，Georg Nagel实验室和Karl Deisseroth实验室的联合研究证实，光激活细菌(信号转导)通路channelrhodopsin-2(ChR2)能活化神经信号(转导)。由于该过程简单易操作，激发了神经科学家的极大兴趣。